基因定點(diǎn)整合可替換特定基因，該技術(shù)可用于單基因遺傳病的治療。苯丙酮尿癥是由PKU基因突變引起的，將正常PKU基因定點(diǎn)整合到PKU基因突變的小鼠胚胎干細(xì)胞的染色體DNA上，替換突變基因，可用來研究該病的治療過程。定點(diǎn)整合的過程是：從染色體DNA的突變PKU基因兩側(cè)各選擇一段DNA序列HB1和HB2，根據(jù)其堿基序列分別合成HB1和HB2，再將兩者分別與基因K1、K2連接，中間插入正常PKU基因和標(biāo)記基因neo^r，構(gòu)建出如圖所示的重組載體。重組載體和染色體DNA中的HB1和HB2序列發(fā)生交換，導(dǎo)致兩者之間區(qū)域發(fā)生互換，如圖所示。回答下列問題：

（1）構(gòu)建重組載體，常用的工具酶有

限制酶、DNA連接酶

限制酶、DNA連接酶

。構(gòu)建重組載體時，需要大量PKU基因，常用

PCR

PCR

技術(shù)合成PKU基因，利用該方法合成PKU基因時需要設(shè)計并合成

2

2

種引物。
（2）題干中所用胚胎干細(xì)胞可以來自

早期胚胎或原始性腺

早期胚胎或原始性腺

。培養(yǎng)過程中大部分細(xì)胞會貼附在培養(yǎng)瓶壁生長，當(dāng)貼壁細(xì)胞分裂生長到表面相互接觸時，細(xì)胞就會停止分裂，這種現(xiàn)象稱為

接觸抑制

接觸抑制

。
（3）實驗過程中，為了提高胚胎的利用率，可采用胚胎分割技術(shù)，若選用囊胚期的胚胎，操作過程中要特別注意將內(nèi)細(xì)胞團(tuán)均等分割，原因是

保證分割后的每一個胚胎的恢復(fù)和正常發(fā)育

保證分割后的每一個胚胎的恢復(fù)和正常發(fā)育

。
（4）用圖中重組載體轉(zhuǎn)化胚胎干細(xì)胞時，會出現(xiàn)PKU基因錯誤整合。錯誤整合時，載體的兩個K基因中至少會有一個與neo^r一起整合到染色體DNA上。已知含有neo^r的細(xì)胞具有G418的抗性。K1、K2的產(chǎn)物都能把DHPG轉(zhuǎn)化成有毒物質(zhì)而使細(xì)胞死亡。轉(zhuǎn)化后的胚胎干細(xì)胞依次在含有G418及同時含有G418和DHPG的培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，在雙重選擇下存活下來的是

正確整合

正確整合

（填“正確整合”或“錯誤整合”）的胚胎干細(xì)胞，理由是

能在含有G418的培養(yǎng)液中存活說明轉(zhuǎn)化后的胚胎干細(xì)胞中含有neo^r，能在同時含G418和DHPG的培養(yǎng)液中存活說明轉(zhuǎn)化后的胚胎干細(xì)胞中含有neo^r且不含K基因

能在含有G418的培養(yǎng)液中存活說明轉(zhuǎn)化后的胚胎干細(xì)胞中含有neo^r，能在同時含G418和DHPG的培養(yǎng)液中存活說明轉(zhuǎn)化后的胚胎干細(xì)胞中含有neo^r且不含K基因

。