基因組中大片段DNA的定向整合擁有廣闊的應用前景，目前細菌中的定向整合系統(tǒng)存在諸多不足，如效率偏低，缺乏有效的篩選標記物，可整合的片段大小有限（3～4kb）等。研究者嘗試構建CRISPR RNA-guided定向整合系統(tǒng)以改善上述缺陷。
（1）Cas蛋白是一種RNA引導的內切酶，能催化雙鏈DNA在特定位點斷裂。crRNA是一種短鏈RNA，它一端可與Cas蛋白結合，另一端通過 堿基互補配對堿基互補配對原則與目標DNA序列結合。
（2）轉座子（Tn）是一段特殊的DNA片段。轉座酶A和轉座酶B相互結合后可將Tn從原有的DNA鏈上切下，并將其整合到其他DNA片段上。為了使轉座子定向整合到特定的位置，研究者構建了圖1所示的CRISPR RNA-guided定向整合系統(tǒng)，導入大腸桿菌，并統(tǒng)計定向整合的效率，結果如圖2。
①構建重組質粒時，應將翻譯終止序列設置在Cas基因和轉座酶A基因之后而不是設置在兩者之間，目的是 讓Cas蛋白和轉座酶A形成融合蛋白，便于Cas蛋白引導轉座酶定位到crRNA所結合的DNA附近，實現(xiàn)轉座子的定向整合讓Cas蛋白和轉座酶A形成融合蛋白，便于Cas蛋白引導轉座酶定位到crRNA所結合的DNA附近，實現(xiàn)轉座子的定向整合。
②由圖2結果可知，轉座子的定向整合效率高低與 轉座子整合的方向轉座子整合的方向密切相關。為保證轉座子連接方向與預期相同，構建重組質粒的過程中，對切割轉座子和切割載體的限制酶的要求是 利用兩種不同的限制酶切割轉座子和載體，且保證黏性末端的連接方向與預期相同利用兩種不同的限制酶切割轉座子和載體，且保證黏性末端的連接方向與預期相同。
③由圖2結果可知，該系統(tǒng)還能有效解決篩選標記物缺乏的問題，理由是 RL方向的定向整合效率接近100%，無需再用標記物進行篩選RL方向的定向整合效率接近100%，無需再用標記物進行篩選。
（3）研究者替換了不同長度的轉座子，繼續(xù)檢測定向整合效率，結果如圖3。
與現(xiàn)有的定向整合系統(tǒng)相比，CRISPR RNA-guided定向整合系統(tǒng)可整合的片段大小得到提高，判斷依據(jù)是 當轉座子長度大于3～4kb時，定向整合效率依然接近100%當轉座子長度大于3～4kb時，定向整合效率依然接近100%。
（4）利用該系統(tǒng)能實現(xiàn)基因定向整合的特點，舉例說出其在科學研究中還可以有哪些應用：將轉座子插入特定基因，破壞該基因的結構，形成基因缺陷突變體，用以研究該基因的功能將轉座子插入特定基因，破壞該基因的結構，形成基因缺陷突變體，用以研究該基因的功能。（舉出一例即可）
【答案】堿基互補配對；讓Cas蛋白和轉座酶A形成融合蛋白，便于Cas蛋白引導轉座酶定位到crRNA所結合的DNA附近，實現(xiàn)轉座子的定向整合；轉座子整合的方向；利用兩種不同的限制酶切割轉座子和載體，且保證黏性末端的連接方向與預期相同；RL方向的定向整合效率接近100%，無需再用標記物進行篩選；當轉座子長度大于3～4kb時，定向整合效率依然接近100%；將轉座子插入特定基因，破壞該基因的結構，形成基因缺陷突變體，用以研究該基因的功能
【解答】
【點評】
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發(fā)布：2024/4/20 14:35:0組卷：11引用：2難度：0.7
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